Instrucciones para estaciones de trabajo OT-2 de Opentrons para una automatización eficiente del laboratorio

Hoja de preparación
Mediciones y análisis estadístico

Escrito por Kennedy Bae, Ph.D. y Kinnari Watson, Ph.D.

Empezando

Antes de enseñar el plan de la lección, complete los siguientes pasos antes de la clase.

Desempaquetado del OT-2
Configurar la aplicación Opentrons
Colocar pipetas
Calibrar la plataforma
Calibrar la longitud de la punta y el desplazamiento de la pipeta
Importar cualquier protocolo relacionado a la aplicación
Pruebe el protocolo en el OT-2

¿Necesita ayuda adicional?

Para obtener asistencia técnica, consulte nuestra Centro de ayuda de Opentrons Para obtener artículos relevantes, si necesita más ayuda, póngase en contacto con soporte@opentrons.com.

Si tiene preguntas relacionadas con el plan de la lección, comuníquese con los autores, Kennedy Bae, en kennedy@opentrons.com, o Kinnari Watson, en kinnari@opentrons.com.

Guía para educadores
Mediciones y análisis estadístico

Escrito por Kennedy Bae, Ph.D. y Kinnari Watson, Ph.D.

Objetivo

Este laboratorio tiene como objetivo desarrollar la comprensión de los estudiantes sobre el uso de diluciones seriadas para generar una curva estándar y el uso de curvas estándar para interpolar sampLos valores. Esto incluye una apreciación de:

• Habilidades básicas de pipeteo
• Diluciones seriadas
• Medición de réplicas
• Rango de la curva estándar
• Uso de estadísticas para evaluar la significación

Los estudiantes realizan el pipeteo manual en paralelo con el manejo automatizado de líquidos, lo que les permite ver las fortalezas y oportunidades de ambas técnicas.

Audiencia estudiantil

Este laboratorio fue diseñado para su uso en cursos de biología de nivel inicial y medio para estudiantes de grado. Es flexible para adaptarse a cualquier cantidad de estudiantes inscritos en la clase.

Conocimientos previos

Los estudiantes deben tener una comprensión conceptual del pipeteo, la espectrofotometría, las curvas estándar y el análisis estadístico.

Competencias básicas

Habilidades de laboratorio
Pipeteo, sampLa preparación y el uso de equipos de automatización de laboratorio.

Análisis de datos
Desarrollo de curvas estándar, interpolación y análisis estadístico

Pensamiento crítico
Interpretación de datos experimentales, resolución de problemas y extracción de conclusiones razonables.

Suministros

Protocolo Opentrons

Descargar protocolo desde
https://protocols.opentrons.com/protocol/customizable_s erial_dilution_ot2

• Seleccione los siguientes parámetros en el webpágina según su configuración y suministros:
  • Tipo de pipeta
  • Lado de montaje
  • Tipo de punta
  • Tipo de canal
  • Tipo de placa
• Mantenga la configuración predeterminada para:
  • Factor de dilución (3)
  • Número de diluciones (10)
  • Volumen total de mezcla (150)
  • Vacío en placa de pocillos (sí)
  • Estrategia de uso de la punta (utilizar una punta)
  • Volumen del entrehierro (10)

Equipos Opentrons

Robot automatizado de manipulación de líquidos Opentrons OT-2
Pipeta de 300 canales Opentrons p8

Equipos que no son Opentrons

Espectrofotómetro basado en placas
Software para análisis de datos (por ejemplo, Excel o software de estadística especializado)
Pipetas manuales de volumen variable P1000 (una por estudiante)
Pipeta manual de volumen variable P100 (solo se requiere una para demostrar la Parte A)

Material de laboratorio

Rack de puntas Opentrons de 300 μL
Canal de 12 pocillos
Placa de fondo plano de 96 pocillos
Tubos de ensayo (6 por alumno)
Gotero (1 por estudiante)

Reactivos

1000 mL de diH20 por estudiante
FD&C Azul N° 1 (McCormick® se utilizó en el desarrollo de este laboratorio)

Duración experimental

Sesiones de clase obligatorias
1

Tiempo de ejecución del laboratorio
Tiempo total estimado: 2.5-3 horas
Introducción y generación de curvas de calibración: 35 minutos
SampPreparación y pipeteo: 1 hora
Recolección de datos: 30 minutos

Solución de problemas básicos

1. Haga una prueba antes de la clase; de ​​esta manera, cualquier imprevisto se puede resolver antes de que lleguen los estudiantes.
2. Los problemas con las puntas que chocan con las placas casi siempre se deben al uso de material de laboratorio alternativo o a la calibración del robot. Si experimenta esto y ha confirmado que el material de laboratorio es correcto, intente recalibrar el robot.
3. Si necesita comunicarse con el soporte de Opentrons, infórmeles que es parte de nuestro programa Opentrons for Education y la fecha de su próxima clase de laboratorio.

Actividades previas al laboratorio obligatorias

Antes de comenzar este laboratorio, los estudiantes deben tener las siguientes habilidades técnicas y conocimientos teóricos:

• Cargue una punta de pipeta en una pipeta manual
• Ajustes de volumen para pipetas manuales
• Conocimientos teóricos de espectrofotometría: el educador manejará el espectrofotómetro para este laboratorio.
• Comprensión de las curvas estándar, incluido el conocimiento de la ecuación que define la curva y la capacidad de interpolar valores.
• Un sólido conocimiento del análisis estadístico básico, incluido el cálculo y la interpretación de medias, desviaciones estándar y R².

Guía de procedimientos

1. Introducción al laboratorio ~ 15 minutos

Lo ideal es que los estudiantes lean la guía de laboratorio antes de venir a clase, sin embargo, planifique pasar 10 minutos discutiendo técnicas de pipeteo, review de curvas estándar e interpolación sampvalores le.

2. Generación de curva de calibración ~ 20 minutos

A continuación, demuestre la generación de la curva estándar (Parte A) para la clase (este laboratorio supone que el educador será el único operador del robot OT-2 y el espectrofotómetro):

1. Prepare la solución de colorante azul con 50 μL de colorante alimentario azul y 10 mL de diH2O.
2. Agregue 200 μL de la solución de colorante azul a los pocillos A1-H1 de la placa de fondo plano de 96 pocillos.
3. Agregue 20 ml de agua al pocillo A1 del depósito del canal.
   (Nota: La columna después de la última dilución es la ubicación predeterminada de los espacios en blanco. El último pocillo del canal/depósito es el residuo líquido predeterminado).
4. Organice el material de laboratorio de la siguiente manera:
   a. Ranura 1 = Rack de puntas Opentrons de 300 μL
   b. Ranura 2 = depósito de 12 canales
   c. Ranura 3 = placa de fondo plano de 96 pocillos
5. Vaya a la aplicación de ejecución OT-2 para ejecutar el protocolo.
6. Cuantificar la absorbancia de la placa de 96 pocillos a 450 nm.

3. Discusión ~ 5 minutos

Después de ejecutar las diluciones seriadas y generar la curva estándar, es posible que desee volver a reunirse como clase y analizar las fortalezas y oportunidades de la automatización.

4. Parte B: Manual Sample Preparación ~ 1 hora

Durante esta parte del laboratorio, se les pedirá a los estudiantes que completen de forma independiente la Parte B del laboratorio:

1. Utilice un tubo de ensayo para recoger una alícuota de 200 μL del colorante concentrado.
2. Utilice un segundo tubo de ensayo para recoger 4 ml del diluyente (diH2O).
3. Pipetea al menos 800 μL de diH20 en cada uno de los 4 tubos restantes. Estos se convertirán en tus sampLes.
4. Utilice el gotero para dispensar cantidades variables del tinte concentrado en cada sample tubo.
5. Pipetee 200 μL de su primera muestra.ampColoque la muestra en un pocillo de la placa de 96 pocillos. Repita esto 3 veces más para que tenga 4 réplicas de esa muestra.ampColoque la muestra en 4 pocillos de la placa. Anote en qué pocillos colocó esta muestra.ample into (es probable que comparta su placa de 96 pocillos con otros estudiantes; desea saber cuál samp¡les son tuyos!).
6. Repita el paso anterior para los 3 segundos restantes.amples. Debes tener 4 pocillos de cada unoample, para un total de 16 pocillos, llenó la placa de 96 pocillos.
7. Cuantificar la absorbancia de la placa de 96 pocillos a 450 nm.

Mientras los estudiantes completan la Parte B, planifique circular por el laboratorio para responder preguntas y observar la técnica de pipeteo de los estudiantes, recordándoles que registren qué pocillos están usando y brindándoles ayuda individual según sea necesario.

5. Recopilación de datos ~ 30 minutos

Permita 30 minutos para la recopilación de datos.

6. Desglose ~ 10 minutos

Deje tiempo al final del laboratorio para presentar brevemente el informe de laboratorio y brindarles a los estudiantes tiempo suficiente para limpiar sus estaciones y hacer las preguntas restantes.

Informe de laboratorio

Instrucciones

Asigne a los estudiantes la preparación de un informe de laboratorio completo que incluya datos de la curva de calibración, ecuaciones interpoladas y ecuaciones diferenciales.ampValores de le y análisis estadístico. Proporcione pautas para la estructura del informe y la presentación de datos. A continuación se presentan algunas ideas para la exploración.

• Establecer la curva estándar
  • Agregue los valores individuales para sus estándares.
  • Encuentra la media y la desviación estándar en cada uno.
  • Utilice los valores medios para definir la curva estándar.
  • Determine qué tan bien se ajusta la curva calculada a los puntos de datos calculando el valor R2. Recuerde que una línea que se ajusta perfectamente a los puntos de datos tiene un valor R2 de 1. Es importante crear una nueva curva estándar con un valor R2 calculado para cada experimento.
• Interpolación de SampLos valores
  • Utilice la curva estándar calculada para interpolar samplos valores manualmente.
  • ¿Cuál es la desviación estándar entre las réplicas de cada una de sus muestras?amp¿ellos?
  • ¿Cuales son algunas posibles razones para esta variación?
  • ¿Cuáles son los beneficios de medir réplicas?
• ¿Qué tendencias puedes observar entre diferentes conjuntos de datos?amp¿Alguna de las diferencias observadas es estadísticamente significativa?
  • ¿Existen valores atípicos? ¿Cómo permite el uso de estadísticas evaluar los valores atípicos en lugar de seleccionar datos de forma selectiva?

Guía del estudiante
Mediciones y análisis estadístico

Objetivo

Este laboratorio desarrollará su comprensión del uso de diluciones seriadas para generar una curva estándar y el uso de curvas estándar para interpolar sampLos valores. Esto incluye una apreciación de:

• Habilidades básicas de pipeteo
• Diluciones seriadas
• Medición de réplicas
• Rango de la curva estándar
• Uso de estadísticas para evaluar la significación

En este laboratorio, los estudiantes utilizarán datos obtenidos mediante pipeteo manual, así como con el manipulador de líquidos automatizado OT-2, lo que les permitirá ver las fortalezas y oportunidades de ambas técnicas.

Equipo necesario

• Robot automatizado de manipulación de líquidos Opentrons OT-2
• Pipeta de 300 canales Opentrons p8
• Rack de puntas Opentrons de 300 μL
• Pipeta manual (P1000)
• Canal de 12 pocillos
• Placa de fondo plano de 96 pocillos
• 1000 mL de agua desionizada (diH2O)
• FD&C Azul N° 1 (McCormick® se utilizó en el desarrollo de este laboratorio)
• 6 tubos de ensayo
• Cuentagotas

Procedimiento experimental

Parte A: Observar Generación de curva estándar

El OT-2 realizará el pipeteo automático de las diluciones seriadas. Cuando su docente mida estos estándares con el espectrofotómetro, podrá generar una curva estándar.

Su educador seguirá estas instrucciones para preparar y poner en funcionamiento el robot OT-2. Los pasos 1 a 4 se completarán manualmente (por su educador o estudiantes voluntarios) antes de poner en funcionamiento los pasos automatizados del robot OT-2:

1. Prepare la solución de colorante azul con 50 μL de colorante alimentario azul y 10 mL de diH2O.
2. Agregue 200 μL de la solución de colorante azul a los pocillos A1-H1 de la placa de fondo plano de 96 pocillos.
3. Agregue 20 ml de agua al pocillo A1 del depósito del canal.

(Nota: La columna después de la última dilución es la ubicación predeterminada de los espacios en blanco. El último pocillo del canal/depósito es el residuo líquido predeterminado).

4. Organice el material de laboratorio de la siguiente manera:

ο Ranura 1 = Rack de puntas Opentrons de 300 μL
ο Ranura 2 = depósito de 12 canales
ο Ranura 3 = placa de fondo plano de 96 pocillos

5. Vaya a la aplicación de ejecución OT-2 para ejecutar el protocolo automatizado.

ο Descargar protocolo desde
https://protocols.opentrons.com/protocol/customiza ble_serial_dilution_ot2

• Seleccione los siguientes parámetros en el webpágina según su configuración y suministros:
  • Tipo de pipeta
  • Lado de montaje
  • Tipo de punta
  • Tipo de canal
  • Tipo de placa
• Mantenga la configuración predeterminada para:
  • Factor de dilución (3)
  • Número de diluciones (10)
  • Volumen total de mezcla (150)
  • Vacío en placa de pocillos (sí)
  • Estrategia de uso de la punta (utilizar una punta)
  • Volumen del entrehierro (10)

6. Cuantifique la absorbancia de la placa de 96 pocillos a 450 nm.

Nota: Las diluciones en serie se realizan transfiriendo secuencialmente alícuotas de un estándar a cantidades crecientes de diluyente (ver diagrama). El OT-2 aspirará una alícuota de los estándares concentrados y la dispensará en el diluyente. Luego mezclará el colorante concentrado y el diluyente pipeteando repetidamente el líquido hacia arriba y hacia abajo. Luego, el robot aspirará una alícuota del primer estándar mezclado y la dispensará en la siguiente columna de diluyente.

Parte B: Conducta manualesample preparación

1. Utilice un tubo de ensayo para recoger una alícuota de 200 μL del colorante concentrado.
2. Utilice un segundo tubo de ensayo para recoger 4 ml del diluyente (diH2O).
3. Pipetea al menos 800 μL de diH20 en cada uno de los 4 tubos restantes. Estos se convertirán en tus sampLes.
4. Creando diferentes samples con diferentes cantidades de concentrado versus diluyente: use el gotero para dispensar diferentes cantidades del tinte concentrado en cada sample tubo.
5. Pipetee 200 μL de su primera muestra.ampColoque la muestra en un pocillo de la placa de 96 pocillos. Repita esto 3 veces más para que tenga 4 réplicas de esa muestra.ampColoque la muestra en 4 pocillos de la placa. Anote en qué pocillos colocó esta muestra.ample into (es probable que comparta su placa de 96 pocillos con otros estudiantes que desea saber cuál es)amp¡les son tuyos!).
6. Repita los pasos 5 y 6 para los 3 segundos restantes.ampLes, por lo que terminas con 4 réplicas de cada sample en 4 pocillos. Debes hacer 4 pocillos de cada unoample, para un total de 16 pocillos, llenó la placa de 96 pocillos.
7. Cuantificar la absorbancia de la placa de 96 pocillos a 450 nm.

Cuestionario para estudiantes
Mediciones y análisis estadístico

Cuestionario para estudiantes

1. ¿Cuál es el beneficio de utilizar diluciones seriadas para generar una curva estándar?
2. ¿Por qué es importante la generación de curvas de calibración en las mediciones biológicas?
3. Nombre un desafío potencial en la generación de curvas de calibración y sugiera una solución.
4. Describe la función del equipo utilizado en este laboratorio.
5. ¿Cuáles son las fuentes comunes de variabilidad del pipeteo manual?
6. ¿Por qué es útil medir réplicas de cada s?ampel?
7. ¿Cuál es el propósito de interpolar s?amp¿Cuáles son los valores en este experimento?
8. ¿Cómo puede el análisis estadístico ayudar a interpretar las diferencias entre varios sistemas?amp¿ellos?
9. ¿Cómo podrían los hallazgos de este laboratorio ser relevantes para la investigación biológica?

Documentos / Recursos

Estaciones de trabajo OT-2 de Opentrons para una automatización eficiente del laboratorio [pdf] Instrucciones Estaciones de trabajo OT-2 para una automatización eficiente del laboratorio, OT-2, Estaciones de trabajo para una automatización eficiente del laboratorio, Automatización eficiente del laboratorio, Automatización del laboratorio, Automatización

Referencias

• Manual de usuario